非病毒「新型递送」VLP、外泌体、GalNAc、SORT-LNP…全面开花

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2023年2月12日/医麦客--星耀研究院新闻 PharmaBIGStar News/--当下，在纷繁的核酸类药物的开发与临床应用中，递送系统的挑战已经是一个老生常谈的问题。由于核酸分子必须在胞内甚至核内才能发挥作用，因此这类药物最终在临床发挥药效的关键绝大部分取决于一个安全高效的递送系统，而这也是当前核酸类药物研发的一大关键技术难题。

目前，用于核酸物质（包括RNA、DNA以及小核酸）的递送方法主要分为两类，病毒载体和非病毒载体。其中，病毒载体依然是作为承担递送任务的主力军，以AAV为代表的基因治疗产品在生产和应用上已经较为成熟，但依然存在插入风险、包装上限、一次性给药以及肝毒性等问题。

为弥补病毒载体的缺陷，近年来利用非病毒载体进行药物递送成为一种极具潜力的替代方案。相较于传统病毒载体，其具有毒性低、免疫反应低，载体容量大，材料来源广泛，易于大量制备且所携带的基因不整合至宿主细胞基因组等方面的优势。最近几年来，非病毒载体在临床试验中的应用也呈现出逐渐上升的趋势，其中研究应用较多的非病毒载体主要包括LNP（脂质纳米颗粒）、GalNAc、外泌体、VLP(VLP-mRNA、SEND)等新型递送技术。

外泌体、VLP新型递送显露锋芒

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外泌体

细胞外囊泡（外泌体）是真核细胞和原核细胞分泌的天然存在的纳米颗粒。相比于人工合成的载体，外泌体作为一种天然的纳米药物递送载体具有免疫原性低、较长的体液循环时间和跨越血脑屏障等优势，被认为是理想的新一代药物递送载体。

▲外泌体结构组成（图源参考资料1）

近年来，外泌体作为新型药物的递送载体引起了行业的关注，其可以用来递送核酸、蛋白质和小分子药物等。到目前为止已经有众多利用外泌体递送药物治疗心血管病、帕金森氏症、阿尔茨海默病，以及其他神经退行性疾病等的案例。

Codiak BiosciencesengEx™

Codiak开发engEx™外泌体治疗平台，该平台利用外泌体的载体特性，将治疗性分子整合到外泌体表面或囊泡内部，以递送到目标位置，创建定制的具有强效临床前抗肿瘤活性的候选药物。

Codiak公司通过engEx™平台，能够使用两种策略将治疗性分子整合到外泌体中分子工程和外源性药物负载。这两个策略可以独立使用，也可以组合使用。

EvoxDeliverEX™

DeliverEX™是Evox专有的外泌体递送技术平台，其可以设计和修饰外泌体，并将蛋白质、RNA药物以及其它类型的小分子药物加载到被修饰的外泌体中，使其靶向目标组织。并且已经证实了DeliverEXTM能成功的将药物递送到靶器官中，尤其是向大脑和中枢神经系统的递送。

MDimuneBioDrone平台技术

BioDrone平台是一种基于CDV（细胞衍生囊泡）的药物递送系统（DDS）。它是一个突破性的药物输送平台，通过将各种药物加载到CDV上，将它们选择性地输送到特定病变位置。该平台主要通过挤压的方法从各种细胞来源生产大量的外泌体，进而实现特定目标的靶向递送，降低药物剂量和副作用，并将药物疗效最大化。

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病毒样颗粒（VLP）

VLP（virus-like particle）是一种可以感染细胞但缺乏病毒遗传物质的病毒蛋白组装体，这种来源于病毒指甲的载体可利用病毒特性实现有效的细胞内递送，包括mRNA、蛋白质或者核糖核蛋白（RNP）等药物分子，具有封装药物、内涵体逃逸的功能，表面颗粒经设计可靶向不同的细胞类型。

目前，基因编辑领域的大牛张锋、刘如谦、本导基因以及VBI疫苗公司等均开发了这一递送系统。

本导基因----VLP-mRNA

2021年1月，本导基因联合创始人蔡宇伽团队相继在Nature Biotechnology和Nature Biomedical Engineering杂志上发表了其自主研发的VLP-mRNA技术以及动物疾病模型的应用研究，在小鼠模型中证明了VLP递送CRISPR可治疗疱疹性基质型角膜炎（HSK）。慢病毒载体可以高效感染几乎所有的细胞，而非病毒成分mRNA具有瞬时性的特点，蔡宇伽团队利用mRNA茎环结构与噬菌体衣壳蛋白特异识别的原理，通过病毒工程技术，将两者的优点完美的结合起来，创造了新型递送技术VLP-mRNA。

▲BDmRNA 平台（图源本导基因）

基于这项技术本导基因创建了领先的类病毒体BDmRNA技术平台，实现了CRISPR等基因编辑工具安全、高效的递送，这种递送技术可以确保基因编辑酶在体内瞬时表达（72小时内降解），降低基因编辑脱靶概率，提高基因编辑药物的安全性。而就在近日，公司首个由VLP介导的体内基因编辑疗法BD111正式申报临床并获得受理，这也是全球第三款进入IND和临床阶段的体内基因编辑治疗候选药物。

Aera Therapeutics----SEND

Aera Therapeutics是2021年张锋团队基于其开发的SEND技术而孵化，目前Aera Therapeutics已完成由 Arch 和 Google Ventures 提供的2亿美元融资。

SEND是一种全新的RNA递送平台，其核心是逆转录病毒样蛋白PEG10，它能够与自身的mRNA结合并在其周围形成球型保护囊。2021年8月，张锋团队在Science发表的一项“Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery ”研究论文中，使用SEND系统将CRISPR-Cas9基因编辑系统成功递送到小鼠和人类细胞并对目标基因进行了编辑。

在文章中，研究团队将其改造设计后用来包装和递送RNA。首先，在PEG10的mRNA序列中找到了识别和包装其RNA的序列，然后对PEG10蛋白和该mRNA序列进行改造，以便PEG10能够选择性包装RNA。然后用融合蛋白修饰PEG10蛋白，以促进其与细胞膜的融合，帮助其更好地进入细胞。通过这一系列的改造，PEG10有望靶向特定种类的细胞、组织或器官，并进行RNA递送。

▲SEND系统

SEND系统是利用人类内的组分自组装为病毒样颗粒，与其他递送载体相比，所引起的免疫反应更少，更具安全性。目前，SEND递送策略尚处于应用的起步阶段。

除以上两家企业之外，David Liu团队也依托其开发的工程化病毒样颗粒（eVLP）创立了Nvelop Therapeutics公司。与本导基因的VLP不同，这一eVLP载体装载的是蛋白质，能有效包装和递送碱基编辑器或Cas9核糖核蛋白（RNP），且其携带的蛋白分子比之前多出16倍，并将体内或体外基因编辑的效率也提高了8-26倍。未来或许也将用于递送其他治疗性蛋白。

LNP、GalNAc担当主流

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LNP

LNP已成为核酸药物递送最常用的非病毒载体之一，已被广泛用于siRNA、mRNA等药物的递送。由于LNP比较容易被抗原呈递细胞吸收，因此最常被用于疫苗制备，目前三大mRNA疫苗巨头企业Moderna、CureVac和BioNTech均采用了LNP递送技术。

▲国内部分mRNA药物企业递送技术（图片来源星耀研究院）

但基于目前LNP的组织靶向主要局限于肝脏，在静脉注射后，80%-90%的LNP会进入肝脏，最终被肝细胞吸收。因此不少企业也竞相开发非肝脏组织靶向的新型LNP递送系统。

SORT-LNP——实现器官特异性靶向

选择性器官靶向的LNP递送系统SORT-LNP平台是由ReCode公司联合创始人德克萨斯大学Daniel J. Siegwart教授所开创。2020年4月，该研究团队在Nature Nanotechnology上发表了SORT-LNP相关技术成果并被Nature评为“2022年值得关注的七项技术”之一。基于该技术平台，ReCode公司目前在中枢神经系统、肝脏、肿瘤领域开发mRNA疗法。

SORT-LNP的技术特色在于创造性地向LNP中引入了“第五要素”。传统的LNP大多包括4种组分可电离的阳离子脂质、两亲性磷脂、聚乙二醇化脂质和胆固醇。而SORT-LNP则向LNP中引入了第5种脂质成分（SORT分子），形成其独特的脂质配方设计，可以将mRNA或基因编辑系统靶向递送至特定组织。相比传统的LNP技术SORT-LNP平台具有几个主要的优势

能够实现高度选择性和器官靶向性，并且可用于肝外组织的药物递送，这是一个区别于一般LNP技术的明显优势；

能够递送多种类型的基因药物，如mRNA、siRNA、DNA或是混合型药物等；

可通过多种方式进行给药，包括静脉注射、吸入、皮下注射等。

▲ SORT-LNP技术平台 （图片来源ReCode）

在2021年12月，该技术的另一位开创者程强等人在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上发表了题为“On the mechanism of tissue-specific mRNA delivery by selectivean targeting nanoparticles ”的研究论文，进一步分析了SORT-LNP 突破肝脏积聚限制，实现器官组织特异性靶向的具体机制。

首先，聚乙二醇化脂质（PEG 化脂质）从LNP表面解离并暴露出SORT分子；接下来，不同的血清蛋白识别暴露的SORT分子，并吸附在LNP表面；最后，表面吸附蛋白与靶器官中细胞表达的同源受体相互作用，以促进mRNA递送。

基于这些经验与发现，该技术开创者之一程强博士在国内作为科学创始人还创立了星锐医药，致力于开发下一代LNP载体，实现组织特异性mRNA 药物递送，拓宽mRNA药物的应用前景。2022年5月，星锐医药完成了1.5亿元A轮融资。目前，该公司已建立起差异化STAR -LNP递送技术平台，研发管线涵盖了传染病疫苗、肿瘤免疫、代谢疾病等领域。

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GalNAc 

与复杂的 LNP 配方不同，GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）是一种更简单、更小且成分明确的肝脏靶向递送方法。GalNAc-核酸偶联物是由GalNAc和核酸共价连接而成，其完整结构可以在固态寡核苷酸合成仪上合成并通过质谱进行化学表征。

GalNAc-核酸偶联物可分为3部分分别为三触GalNAc靶头、连接臂以及小核酸分子。其中，GalNAc靶头可以与去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）特异性结合，实现细胞的快速胞吞，由于ASGPR主要在肝实质细胞表面高表达，因此，该技术具有高度的肝靶向特异性，给药后高效富集到肝组织，进入其他组织的量非常少。

▲ 将GalNAc-siRNA递送到肝细胞中（图源参考资料2）

Alnylam是最早进入GalNAc递送领域的企业之一，早在十几年前便证明具备一定结构特征的GalNAc递送系统可成功将核酸药物递送至肝脏，这一里程碑发现促进了GalNAc递送技术的发展。目前国内外其他致力于RNA疗法的企业，如Ionis、Arrowhead、Dicerna、圣诺医药以及瑞博生物、吉迈生物等也纷纷进入GalNAc领域，并构建了自己的GalNAc递送系统。

AlnylamSEC+ GalNAc

其GalNAc技术平台为3个GalNAC配体与广泛修饰的siRNA的正义链连接，采用皮下注射，GalNAc可与肝细胞表面高度表达的ASGPR结合来靶向肝脏。此外，Alnylam在其GalNAc递送技术上进行了改进，在反义链中加入了热不稳定的GNA核苷酸（乙二醇核苷酸）来减轻脱靶效应引起的肝毒性，构建了SEC+ GalNAc平台技术。

除了典型的三触GalNAc递送系统外，国内外企业基于ASGPR/GalNAc递送原理，也构建了与三触GalNAc结构存在显著区别的GalNAc递送系统，并且有部分产品已进入临床II期或III期，未来应用前景可观。

圣诺医药PDoV-GalNAc

2022年8月该公司宣布已成功研发肽对接载体(PDoV™)，将进一步优化公司siRNA药物递送的多肽GalNAc平台，其相较于直接与siRNA结合的GalNAc能更快发挥作用。

PDoV-GalNAc(小肽半乳糖胺偶联平台)利用PDoV具备强化的内涵体逃逸机制的特性，可为两个不同的siRNA抑制剂提供两个结合位点。当PDoV与三价GalNAc连接时，可以高效且特定地将siRNA递送至肝细胞。由于PDoV具备内涵体逃逸更快速的特性，与传统 GalNac技术相比，PDoV-GalNAc递送效率更高并在体内和体外的早期治疗中展现出更强的RNAi活性。

目前，该公司正在基于PDoV-GalNAc递送平台研发新型的siRNA候选药物，包括靶向PCSK9治疗高胆固醇血症的STP135G、靶向乙型肝炎病毒的STP155G等。

此外，圣诺医药还开发出了独有的聚合物纳米颗粒（PNP）导入技术及新型GalAhead药物递送平台。

➤ PNP由天然氨基酸组成，其降解物天然无毒，克服了药物的靶向性和稳定性障碍。且还可以通过局部或全身给药，毒性低、易制造、可递送治疗药物至除肝脏外众多靶向器官。同时，PNP既可递送siRNA也可递送mRNA，并且可同时携带多个不同靶向的siRNA，使其在同一靶向细胞中产生协同的基因沉默效应，从而提高RNAi的药物疗效。

➤ GalAheadGalAhead递送平台是强化版 GalNac技术，通过将GalNAc基团与独特的RNAi触发结构偶联，可以用于下调单类基因（mxRNA，小型化RNAi触发器），以及用于下调多类基因（muRNA，多单位 RNAi触发器）。

DicernaGalXC™

Dicerna是一家专注于研发试验性RNAi治疗药物的生物医药公司，拥有肝脏靶向的GalXC™递送平台以及探索非肝脏靶向GalXC-Plus技术的新应用，以开发下一代RNAi疗法的方法。

GalXC™递送平台包含单价GalNAc偶联的四环结构，区别于Alnylam的三触GalNAc递送系统，GalXC™在正义链中引入了独特的四环结构，可增强偶联物的稳定性，同时，还能准确定位多个GalNAc配体，将siRNA成功递送至肝细胞。

ArrowheadTRiM™

Arrowhead同样是一家致力于开发RNAi疗法的生物公司，目前，该公司开发建立了专有的靶向递送平台TRiM™，其包含一个高效的RNA trigger，根据需要，针对不同的候选药物可针对性的优化以下组件高亲和力靶向配体、连接子、稳定的候选RNA药物、增强药代动力学的结构。通过改变与RNA分子偶联的靶向配体，该平台能够将RNAi疗法特异性地递送到不同的组织中，从而实现治疗不同类型疾病的目的。

▲ TRiM技术平台（图片来源Arrowhead）

结语

与病毒载体相较而言，非病毒载体系统更具有大规模生产的能力和并进行相关化学表征修饰，也减少了其生物安全性上的隐患。根据近几年临床试验以及各大龙头企业的投资和布局趋势，非病毒载体药物的潜力和价值正在逐步体现。

除了以上谈到的几种非病毒载体技术，聚合物纳米颗粒（PNP）、脂质纳米晶体（LNC）、脂质多聚复合物（LPP）等其他一些前沿递送技术也正在逐渐兴起，但还仍需大量的数据来验证其效力与安全性等。总而言之，每种载体技术都各有特点，但最终都将回归到临床需求以及技术本质，期待未来更多新型递送策略被开发，助力基因治疗释放潜力！

参考来源

1. 张盈盈,陈丽青,刘璇等. 外泌体作为药物递送载体的研究进展[J]. 药学学报, 2019,54(06):1010-1016. DOI:10.16438/j.0513-4870.2018-1118

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