细胞疗法「non-virus」时代已来，国内外多款产品进入临床

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2023年2月7日/医麦客--星耀研究院新闻 PharmaBIGStar News/--目前，大部分细胞疗法的制备过程都涉及到病毒载体。以CAR-T疗法为例，通常会使用慢病毒、γ-逆转录病毒等病毒载体转导进行T细胞修饰。获批上市的CAR-T疗法已经证明了病毒载体在CAR-T生产中的高效性，然而这一方法仍存在诸多问题尚待解决（1）病毒载体的制造成本较高，这也影响了最终产品的可及性；（2）病毒载体尺寸较小，目的基因片段的大小受到限制；（3）随机插入的基因片段存在安全性风险，也会导致CAR-T细胞质量良莠不齐；（4）法规和GMP要求使得病毒载体的使用受到一系列严格的规定等等。

相较于病毒转染而言，非病毒转染安全性高、成本低，近年来其潜力和价值正在逐步体现，并呈现出稳定上升的发展趋势。有业内人士认为，非病毒载体正成为细胞疗法工程改造中更通用、灵活、可持续的方案。常见的用于非病毒载体的改造系统包括以下几种

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转座子系统

转座子是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置，根据中间体的不同发挥“复制粘贴”或“剪切粘贴”的作用。在修饰T细胞时，由携带CAR的质粒和转座子酶的质粒组成的转座子经过电穿孔的方式进入T细胞，在T细胞基因组的TA二核苷酸序列上插入CAR基因，转录后在细胞表面表达CAR。这种方法能够搭载更大的目的基因，且免疫原性和成产成本较低。目前，常用的转座子系统有睡美人转座子和PiggyBac转座子。

▲睡美人转座子进行基因递送

（图片来源参考资料1）

➤ 睡美人转座子

睡美人转座子系统由催化转座所需酶和能够在基因组内位移的转座子组成，能够产生特定的DNA插入到动物基因组中。其最早在鱼类基因组中发现，通过转座酶密码子优化、修饰转座子序列、筛选转座酶变体等方法提高睡美人转座子系统基因插入的效率和大片段的转座率。Zsuzsanna Izsvak等人曾改良了转座酶使得效率提高了100倍；Querques等人创建了一种新型转座酶变体，显著提高其稳定性和溶解性，经过其修饰的CD19 CAR-T在小鼠模型中显示出了良好的生物学活性和抗肿瘤能力。

➤PiggyBac转座子

PiggyBac转座子来源于鳞翅目昆虫，有短的末端反向重复序列（ITR）和一个开放编码框（ORF），具有广泛的转座活性。转座时转座酶与转座子末端结合形成短暂的发夹结构，通过其3&39;OH末端攻击靶DNA序列中TTAA位点的5&39;末端，以实现精确整合，其特点是在发挥作用后在供体DNA上不留下足迹。PiggyBac转座子具有较高的安全性，同时，研究人员通过随机突变的方法对转座酶进行了优化，提高了转座效率。

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基因编辑系统

基因编辑技术理论上是一个改造细胞的方式，目前CRISPR/Cas9基因编辑技术是最为常用的一种。但其可能会面临着两大挑战一方面是基因编辑用到的裸露的双链DNA模板对细胞可能存在毒副作用；另一方面是传统的CRISPR/Cas9基因编辑技术通常用于基因敲除而非CAR基因敲入。

针对这些问题，研究人员提出了新的解决方法，即利用含有较低毒性的Cas9目标序列的单链DNA（ssDNA）作为同源定向修复模板，使得T细胞上的IL2RA基因敲入率超过80%，CTLA4的敲入效率超过70%，且修饰后的CAR-T疗法与rAAV载体修饰的CAR-T疗法在细胞免疫表型和体内肿瘤清除速度方面不相上下。此外，当下基因编辑技术正被开发用于CAR-T疗法的非病毒载体制备。

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mRNA

利用电穿孔导入mRNA将CAR导入目标细胞也是一种非病毒修饰的方法。通过对mRNA密码子、5’帽结构、3’polyA尾巴、非编码区域的修饰和优化，能够有效提高mRNA的翻译效率和稳定性。尽管mRNA介导CAR修饰的方法在效率上较病毒载体和转座子而言相对较低，但其成本更低、安全性较高。其改造的T细胞和单核细胞疗法均在展现了较好的抗肿瘤潜力。此外，这一方法也被用于与纳米递送系统结合来在体内瞬时制备CAR-T疗法。

电穿孔及纳米载体

而将上述“工具”递送至细胞内的手段主要有两种，一种是电穿孔技术，另一种是纳米载体。电穿孔通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而将核苷酸、mRNA等外源分子导入细胞内。在经过技术、电转程序等多方面的改进，电穿孔转染效率逐步提高，细胞的存活率也有效提高，能有效降低细胞疗法制备成本。

纳米载体进入细胞和递送基因是由粒子和其有效载荷的理化性质介导的。利用纳米颗粒包裹能够表达CAR的基因递送至T细胞，在T细胞吞噬纳米颗粒后，其中携带的CAR基因能够与染色体结合将其重编程为CAR-T。脂质纳米颗粒（LNP）、合成聚合物纳米载体（NC）均有被报道用于修饰细胞疗法，相关技术的概念证明也已经在小鼠体内完成。

Non-virus已被广泛应用

目前，这些非病毒转染方式已经被用于制备多种细胞疗法，这也是当下细胞疗法的新发展趋势之一。其中，CAR-T细胞疗法是最为集中的方向，另外还包括CAR-NK、CAR-M、TIL疗法、干细胞等。

CAR-T疗法

2022年12月，上海大学附属孟超肿瘤医院研究团队发表了一篇题为“Rapid response in relapsed follicular lymphoma with massive chylous ascites to anti-CD19 CAR-T therapy using Piggy BacA case report”的文章。上海细胞治疗集团细胞药物实验室采用PBmRNA转座子及目的基因质粒对自体单个核细胞进行电穿孔，研发出一款非病毒载体靶向CD19 CAR-T细胞。滤泡性淋巴瘤患者在输注CD19 pbCAR-T细胞后在第28天实现了完全代谢缓解，仅发生了1级细胞因子释放综合症（CRS）。这也是PB转座子技术制备CD19 CAR-T治疗复发滤泡性淋巴瘤患者的国内首例报告。

▲患者接受治疗前后对比

（图片来源官网）

邦耀生物建立了非病毒定点整合CAR-T平台（Quikin CART®），通过电穿孔利用CRISPR基因编辑技术实现基因敲除和CAR元件的定点稳定整合，在不使用病毒载体的情况下将CAR插入到T细胞基因组特定位点，避免了随机插入导致的致瘤风险，同时减少了CAR-T的制备时间和成本。

▲非病毒定点整合CAR-T平台

（图片来源官网）

基于这一技术平台，邦耀生物研发了全球首个CD19非病毒PD1定点整合CAR-T候选产品BRL-201。在治疗复发难治性非霍奇金淋巴瘤的临床试验中，8例接受治疗的患者的客观缓解率（ORR）为100%，完全缓解率（CR）达87.5%。迄今为止，接受治疗的患者无癌生存期最长已超过2年。2022年12月，CDE批准了BRL-201的IND申请。

优卡迪生物创始人俞磊博士曾发表过“Lipid nanoparticles produce chimeric antigen receptor T cells with interleukin-6 knockdown in vivo”的文章，这篇文章描述了用LNP递送实现体内制备CAR-T的方法。研究人员构建了由CD3抗体修饰的脂质纳米颗粒系统，搭载了含有白细胞介素6短发夹RNA（IL-6 shRNA）和CD19-CAR（AntiCD3-LNP/CAR19+shIL6）组合基因的质粒，能够靶向T细胞并稳定转染T细胞。

Cartesian Therapeutics基于RNA Armory℠技术平台开发了一款mRNA工程化自体CAR-T疗法Descartes-08，利用纳米颗粒递送mRNA表达CAR来短暂地表达CAR分子以代替用病毒转染，降低了传统CAR-T疗法存在的安全性风险。2021年8月，Cartesian公布的Descartes-08的1b/2a期临床试验的第一个队列结果显示3例全身性重症肌无力（gMG）的患者在接受治疗3个月后，3例全身性重症肌无力（gMG）的患者。

▲mRNA工程化自体CAR-T疗法

（图片来源官网）

Capstan Therapeutics的创始团队曾在Science上发表过一篇题为“Vaccine-like mRNA Injection Can Be Used to Make CAR T cells in the Body”的文章，报道了利用LNP递送能够编码CAR的mRNA，在体内瞬时工程化T细胞，使生成的CAR-T能够识别心脏纤维化细胞，减少心脏纤维化细胞，并成功修复了小鼠的心脏功能。

CAR-T疗法是目前非病毒细胞疗法领域进展较快的方向，这可能与CAR-T疗法已有上市成功验证，非病毒CAR-T作为创新方向之一吸引了不少创新药企。未来随着非病毒CAR-T疗法的发展，治疗时间、治疗费用将有望降低，而CAR-T的可及性和安全性将进一步得到提高。

CAR-NK疗法

Catamaran Bio建立了一个专有集成技术平台TAILWIND，用于NK细胞的设计和制备。这一平台的TcBuster转座子技术搭载电穿孔手段可实现多基因编辑和大基因有效载荷的高效传递，并具有进行多重细胞工程的能力。同时，TAILWIND平台还利用合成生物学技术编程了新的生物电路、开关和号，以克服TME中的免疫抑制号，促进CAR-NK疗法的持久性。此外，Catamaran还在不断优化NK细胞特定的CAR结构，增强细胞肿瘤杀伤力。

▲TAILWIND平台

（图片来源官网）

基于这一平台，Catamaran Bio研发了CD70 CAR-NK疗法CAT-248和HER2 CAR-NK疗法CAT-179。目前，这两款候选产品尚处于临床前研究阶段。

2023年1月，英百瑞的同源异体外周血来源的通用现货型CAR-raNK细胞产品IBR854细胞注射液获国家药监局临床试验默示许可，这是国内首个针对实体肿瘤的非基因修饰方法的CAR-raNK细胞疗法。IBR854细胞注射液将靶向肿瘤抗原5T4的特异性抗体通过linker与同种异体的NK细胞进行共价偶联，抗体将NK带至肿瘤部位进行定点清除，同时抗体与NK细胞的结合激发了NK细胞的ADCC效应，增强了对肿瘤细胞的杀伤力。其IIT试验中已经展现出了多种实体瘤的治疗潜力。

CAR-M疗法

Myeloid Therapeutics利用LNP递送mRNA改造单核细胞，使其表达固定的CAR。2022年5月，Myeloid宣布其在研疗法MT-101已经在治疗复发/难治性外周T细胞淋巴瘤（PTCL）患者的1/2期临床试验中完成首例患者给药。这也是首次mRNA改造的CD5 CAR单核细胞（CAR-M）疗法完成患者给药。并且患者在接受治疗28天后，未出现严重不良反应。值得一提的是，该公司独有的制造工艺只需一天时间即可完成CAR-M的制备。

▲LNP递送mRNA改造单核细胞过程

（图片来源官网）

TIL疗法

TIL疗法是从肿瘤组织中分离出来的浸润淋巴细胞，这类细胞具有天然的肿瘤识别和浸润优势，只需筛选出特定突变的免疫细胞而不需要进行特定的修饰。随着TIL技术的发展，基因修饰的工程化TIL疗法应运而生，而基因修饰的方法也包括使用病毒载体转基因及非病毒载体的方式修饰。

Iovance的IOV-4001使用了Cellectis授权的TALEN®基因编辑技术敲除了PD-1基因，增强TIL机制的抗肿瘤活性，从而直接靶向杀伤肿瘤细胞。Intima的CISH-KO-TIL利用了CRISPR-cas9技术敲除TIL中CISH基因，经过体外扩增后的细胞仍保留分化程度较低的干细胞特征以增加TIL疗法的持久性。君赛生物首创的新一代基于非病毒载体的基因修饰TIL药物也已进入探索性临床研究阶段。

干细胞

目前进展最快的非病毒修饰干细胞疗法要数CTX001。这是Vertex/CRISPR联合研发的一款通过电穿孔向造血干细胞转入CRISPR/Cas9从而进行基因编辑的体外基因疗法，通过编辑患者自身的造血干细胞，使其在红细胞中产生高水平的胎儿血红蛋白（HbF），从而可以缓解TDT患者的输血需求，并减少SCD患者的疼痛和血管闭塞性危象（VOC）。目前，该公司已经向FDA提交了CTX001的滚动上市申请，这一疗法也被业内寄予高度期待，有可能成为首款获批上市的基因编辑造血干细胞疗法。

总结

整体而言，非病毒细胞疗法正在迅速发展，已有诸多企业布局，越来越多的管线陆续进入到临床，也在很大程度上证明了非病毒转染工艺的日趋成熟。从生产成本、制备速度、监管法规等角度来看，非病毒细胞疗法都有着独特的优势，或许将成为下一代自体细胞疗法的发展方向，大大提高患者可及性。

参考来源

1.Gene Therapy, 2021, doi:10.1038/s41434-021-00254-w

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3.各公司官网

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