肿瘤基因检测样本采集及报告解读常见问答

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 样本采集咨询

01 胸水可以作为检测样本吗？

可以。接收标准如下

1）肿瘤细胞含量不能低于20%

2）送胸水离心后的浓缩液，不能超过20毫升。

3）最好做成蜡块，以便病理质控。

02 FFPE样本送检需注意哪些问题？

1）切片不能粘上盖玻片，否则无法获取盖玻片下的组织，这类样本拒收；

2）免疫组化样本，无法提取，不满足检测要求，拒收；

3）HE染色的片子无法进行NGS检测。

03 FFPE样本送检前需要注意什么？

1）肿瘤细胞含量的多少对检测结果的准确性至关重要，请送符合病理质控要求的HE染色片或白片。

2）FFPE样本符合NGS检测要求包含两部分一是样本量符合要求；二是DNA降解符合要求。因病理科的制片流程并没有对DNA降解及损伤进行质控的要求，但NGS检测需要对DNA降解的水平进行质控，并达到一定要求才能检测，因此送过来的切片样本量符合病理质控要求并不代表就一定能进行NGS检测。

如果DNA降解太严重，无法达到NGS检测需求，也是无法进行检测的。不同的NGS技术对于DNA降解的水平要求不同。华大基因的华梵安和华迦安的质控合格标准是DNA片段长度＞500bp，华翡冉的质控合格标准是DNA片段长度＞250bp。

04 肿瘤组织检测是否都可以做病理质控？

1. 新鲜组织和石蜡样本都可以做病理质控。

2. 新鲜组织在离体后需立即放入且完全浸泡在大于5倍体积的10%中性福尔马林溶液或组织RNA常温保存液中（推荐用组织RNA常温保存液）。

3. 石蜡样本需做病理质控的话，样本寄送要求如下

（1）需带塑料托的石蜡块；

（2）石蜡屑附送1张白片或HE染色片；

（3）石蜡卷附送1张白片或HE染色片；

（4）白片在送检样本的数量上再多加1张。

05 做个性化用药系列产品检测时，样本类型中新鲜组织、石蜡切片、胸腹水、外周血如何进行优先选择？

按照检出率新鲜组织>石蜡切片>胸腹水细胞>外周血；

按照采样便利性外周血>新鲜组织>石蜡切片>胸腹水。

06 肿瘤患者有以前的原发灶标本，和近期胸腔转移灶标本，检测送样时，推荐送哪种样本？

按照样本质量，近期转移灶较好。也可以将原发、转移样本进行混合检测，需注明原发和转移灶，混合检测，但是可能对检测出的基因频率有一定影响。

假如受检者想看原发灶和转移灶的基因突变差别，需要分别送检，分别检测，但是需要收两份检测费用。

07 进行华大基因的华迦安™（206基因）和华梵安™（688基因）基因检测，有组织样本，但是提供不了血液对照，接收吗？不送对照外周血有什么影响？

可以采用唾液中口腔上皮细胞进行对照。此外，经病理医生确认的不含肿瘤细胞的“正常组织”也可作为对照。

华大基因206、688产品主要用于检测肿瘤细胞中的特异性突变，用来指导用药，因此需要对照血过滤正常细胞中的变异。同时688产品还会使用对照血检测63个遗传性肿瘤相关基因上的有害胚系变异，来评估遗传风险，仅有肿瘤组织是无法准确检测胚系变异的。而华翡悦™（肺癌13基因）和华翡冉™（肺癌20基因）检测相对基因数目少，并且有大量的数据积累，因此，可以不需要对照。

08 一位肿瘤患者发生转移且目前状态较差，应该使用肿瘤组织还是外周血进行基因检测？

有一年内的肿瘤组织建议送组织，因一年以上的肿瘤组织有可能DNA降解，无法检测或者检测失败。如果没有一年内的肿瘤组织，就送外周血进行检测。需要注意的是，外周血检测建议只针对IIIB和IV期的患者。

09 患者使用过骨扫描注射氟影像剂，采集对照血时，是否会对后续实验、分析有影响？

不影响，可正常采集患者的对照血。

10 患者注射过脂肪乳，血液呈现乳白色，能否采集外周血进行ctDNA检测？

存在一定检测失败风险。可尝试采集外周血进行检测，在送检单上必须注明患者输过脂肪乳，以及注射时间等息。

11 胆囊癌患者前几天输了白蛋白，做了增强CT，对用药检测有影响吗？

增强CT是临床常用的检测手段。根据目前检测经验，对基因检测的影响不大。

12 患者正在吃抗血管生成的靶药，主病灶缩小了一点，但是肺部有新发转移，想做基因检测，哪种检测比较合适？

正在吃抗血管生成的靶向药，如不停药，对ctDNA检测结果可能有影响。建议通过新发转移部位的活检组织样本进行基因检测。

13 组织保存液如何使用？

华大基因的组织保存液常温保存常温寄送即可，新鲜组织可以在组织保存液中保存至少一个月。

14 组织样本时间要求？

一年内的肿瘤组织样本。

15 导致组织样本降解的原因有哪些？

导致组织样本降解有以下几个原因

1）保存方法。手术切除的组织样本理想的保存方法是迅速置于液氮中，然后保存于液氮罐或-80℃冰箱，这一过程应在手术样本离体后30分钟内完成。组织样本通常需先进行病理学分析，分析完成后应尽早将组织样本置于稳定剂中，避免核酸降解。

2）使用的保存液。应使用中性的福尔马林缓冲溶液，取代无缓冲或酸性的溶液。通常认为福尔马林降解产物会损害核酸的质量，而中性缓冲液可以减缓福尔马林的降解。

3）组织固定程度。组织标本的厚度、福尔马林溶液的体积和固定过程的持续时间的情况对组织固定程度都有影响。固定不足（underfixation）可能导致较深处组织标本，未渗入福尔马林，而发生核酸和蛋白降解。过度固定（overfixation）则导致更密集的交联，让有用核酸和蛋白的提取变得更加困难。

为了获得最佳的结果，通常建议

固定最多5 mm厚的组织标本。

福尔马林与组织的比例至少应为10:1。

组织的固定不应超过24小时，以避免过度固定。

4）组织标本脱水情况。必须完全脱水，因为残留的水分可能导致样品降解。

5）石蜡包埋过程中，温度过高。在使用熔解温度高的石蜡时，可能导致样品降解增加。为了确保从FFPE样品中可用核酸和蛋白的理想回收，应当使用熔解温度低的石蜡。此外，应当避免包含添加剂如蜂蜡的石蜡，因为它们可能干扰生物分子的回收。

6)染色某些染料和试剂可能对核酸造成不利影响，特别是那些用于免疫组化染色的试剂。

7)样品保存FFPE样品应在最佳温度下保存，这样可减缓核酸和蛋白的降解。在比较不同保存温度的实验中，发现如果FFPE样品保存在4°C，而不是室温或更高，则RNA在1年后仍基本完整。

16 如何避免组织样本检测假阴性？

1）需要通过病理质控确认肿瘤细胞含量，肿瘤细胞含量需>20%，坏死细胞

2）DNA容易受固定的影响，长时间（1周以上）浸泡在福尔马林中的样本的DNA会被片段化，不能检出突变。活检材料的固定时间一般是24小时，对于穿刺等活检样本，固定时间控制在6~24小时为佳。

17 福尔马林浸泡过的组织会有粘连的影响导致提取DNA量不足，请问福尔马林浸泡时间有没有标准？

福尔马林主要起到固定蛋白质的作用，导致DNA和蛋白出现交联，不能继续进行高通量检测。

新鲜组织如果在福尔马林浸泡后的样本，也可以尝试送样，但需要按福尔马林样本的送样要求送样，立即将样本转移至组织RNA常温保存液或者生理盐水中进行寄送，并且在样本管壁上注明是“福尔马林浸泡后的样本”，生产人员在DNA提取时就会进行高温解交联。

18 检测ctDNA和组织具体区别是什么？

有三个方面不同

1）样本类型不同；

2）采样时间检测组织没有限制，假如无法取得组织，又处于临床IIIB期后的患者才适合外周血检测；

3）治疗干扰组织检测没有限制，外周血ctDNA检测最好是在没有经过任何治疗之前或治疗后临床确认耐药进展或复发进行采血检测，放化疗和靶向治疗均会对外周血ctDNA检测结果产生影响。

19 ctDNA检测的血液样本在什么时候取合适？样本送检量多少？

对于取不到组织的IIIB、IV期患者，在没经受任何治疗前或治疗后临床确认耐药进展或复发采集ctDNA样本最合适。假如已经化疗，最好化疗结束三周后再采血做检测。

华大基因的ctDNA检测，华翡悦™（肺癌13基因）需要的外周血用量为15mL，华梵安™（688基因）和华迦安™（206基因）需8-10mL外周血。

20 ctDNA样本发生溶血的原因有哪些？

1）与操作技术有关

进针不正确

血标本未及时摇匀

止血带束缚时间过长、过紧

用力拍打采血部位

采血部位消毒剂未干燥即穿刺

针尖固定不好或针尖斜面紧贴血管壁，造成血液中混有大量的泡沫

2）真空负压管不合格

真空负压管负压不够漏气或抗凝剂剂量不足，回血缓慢，血液间断地被吸入负压管内并混有气泡

真空负压管负压过大流入管底速度过快过猛，造成红细胞相互撞击

3）样本运送

标本放置过久储存温度过低可能引起采血管破裂，温度过高可能会引起溶血。

采血量过少也易引起溶血

标本送检过程中剧烈振荡

其他

21 有什么方法可以尽量避免样本发生溶血？

1）掌握采集血液样本的正确方法

选用肘正中静脉或主要静脉，避免选择过细的静脉；

常规消毒、待消毒液干燥后进针，争取一针见血；

止血带结扎时间一分钟内；有回血后即可松止血带；如果使用止血带，病人不要进行松紧拳头的动作；

遇到抽血困难时，不要进行强烈挤压及反复拍打穿刺部位，防止机械性溶血。可进行局部热敷改善血液循环。

2）正确使用真空采血器

按照真空静脉采血管采血顺序进行采血；

血标本应与添加剂充分摇匀，避免动作猛烈；

使用前认真核对真空采血管内抗凝剂是否合适，橡皮塞有无松动、采血管是否完整无裂痕等；

管压过大时，出血口针尖斜插使之靠近管壁，避免距离过大血液撞击试管壁，并松止血带、松拳头。

管压过小时，首先应将采血管向前送，确保胶塞被穿透，然后调整针头在血管内位置，仍未解决可考虑换管。

3）妥善处理血液样本

按照外周血标准采集操作，使用Streck管采取不少于8 mL外周血，采血后请立即轻柔颠倒10次使血液与管内成分混匀（如图1），拖延颠倒混匀时间可能会造成检测失败。混匀后请将采血管直立置于试管架上室温放置（6-35℃）。

图1. 颠倒混匀示意图

采集的血液样本应及时送检，全血应在常温条件下送检，气温高于35摄氏度地区应采取降温措施，但需注意不能直接接触冰块防止溶血。

采集的全血样本存储于6-35℃温度范围，满足从采血起72小时（3日）内抵达华大样本中心，72小时-96小时期间收到的样本，数据质量会有影响。

标本送检过程中避免剧烈振荡。

22 进行华梵安™检测，有组织样本，但是提供不了血液对照，接收吗？不送对照外周血有什么影响？

需要提供血液对照，这样可以筛掉肿瘤组织里的一些正常的基因变异，确保检测出的基因变异都是肿瘤细胞独有的，与肿瘤发生发展相关的。

23 华翡冉™、华翡悦™肺癌小panel为什么不需要对照血？华梵安™和华迦安™为什么都需要对照血检测？

肺癌小panel只解读临床明确的与药物相关的热点突变。

华梵安™和华迦安™检测全部基因的外显子区域，需要对照血筛掉肿瘤细胞里的正常突变，保留肿瘤患者特有的与肿瘤相关的基因突变。

 检测技术咨询

01 测序深度是指什么？

对于靶向测序来说，测序深度是指比对到目标测序区间（targeted region）的测序数据量（碱基总数）与该区间大小的比值，他是评价测序量的重要指标之一。

测序深度分为测序深度分为原始测序深度（raw data）和有效测序深度（clean data）。

测序得到下机数据是原始测序数据，其中会包括一些低质量或重复的数据。通过生算法去除低质量的碱基和重复的检测序列后，得到能够比对到目标测序区间的用于后续分析的高质量序列，即有效测序深度。

02 市场上有ctDNA产品宣传测序深度可达5000X，检测下限达到0.03%。请问华大产品对应的指标分别是什么？灵敏度如何？

对于市面上宣传的测序深度达5000X甚至10000X，需区分这是原始测序深度，还是原始数据（raw data）去重后clean data的有效测序深度。通常，宣传的5000X是指没有去除重复的原始数据（raw data）的测序深度。实际上，原始数据（raw data）中无用的重复数据可能占到60%以上。

目前，华大对应的ctDNA的产品有华梵安™和华迦安™，两款产品的平均测序深度均为去重后clean data的有效测序深度，达1200X，可95%稳定检出的最低检测限是1%，可检出0.6%的基因变异。两款产品灵敏度均在99%以上，部份可达到99.99%。

03 检测报告中对于显示不同Level的药物推荐等级证据是如何定义的？

药物等级证据参考美国病理学会（AMP）、美国医学遗传学和基因组学学会（ACMG）、美国临床肿瘤学会（ASCO）和美国病理学家学会（CAP）共同参与制定的癌种变异解读指南和标准（2017年版），根据生物标志物在诊断、治疗和预后的证据级别，共分为LevelA-D 4个等级；

Level AFDA / NMPA批准或专业指南推荐对某特定肿瘤作为治疗有响应或耐药、诊断或预后的生物标记；

Level B取得该领域专家共识，良好的动力学研究预测对治疗有响应或耐药，或对某疾病的诊断、预后意义；

Level CFDA / NMPA或专业协会/指南批准用于其他肿瘤类型治疗响应或耐药，或已作为临床试验的筛选入组标准，或基于多项小型研究具有诊断或预后意义；

Level D临床前研究显示可能具有治疗意义，对于生物标志物本身或与其他生物标志物一起，基于一些小型研究或未达成共识的多个案例报道，可能有助于疾病诊断或预后意义。  

04 华大ctDNA产品的检测原理是什么？在实验流程中，ctDNA与正常的DNA如何区分？

血液循环系统中有正常组织释放的循环游离DNA（cfDNA）和肿瘤细胞释放的循环肿瘤DNA（ctDNA），通过华大自主研发的超低频检测技术和高通量测序平台，能够捕获到血液中的cfDNA和ctDNA，通过生分析比对和过滤，可以去除掉实验和测序过程中产生的干扰，精确的识别肿瘤细胞来源的ctDNA，确保检测结果准确。

在生分析过程中，会把受检者的DNA与人类参考基因组进行比对，从而识别ctDNA和cfDNA。

05 应用目标区域捕获和高通量测序，能否检测未知的融合基因？是不是需要结合RNA捕获测序技术才行？

根据华大基因检测基因融合的原理，捕获测序可以检测部分未知的融合基因，只要融合基因片段部分匹配到我们的参考序列上，就可以检测未知的融合基因。

 报告解读与分析

01 阴性报告是什么意思？

说明在产品承诺的检测范围和最低检出限内未检测到有临床意义的基因突变的，不排除受检者携带检测范围以外的基因突变，或者基因频率低于最低检出限的基因突变。

02 CNV变异的拷贝数是否会在报告中体现？

目前所有的华大产品报告中会显示拷贝数的具体数值。

03 为什么在有的报告中，显示有基因突变，但是没有用药说明？如EGFR，c.2398G>A， p.D800N突变。

检测出来的基因突变虽然是肿瘤细胞携带的基因突变，但是不是药物的作用靶点，与用药不相关，因此没有用药说明。

04 是否可以出英文报告？

如需出英文报告，请在下单前与工作人员说明。

05 华梵安™组织或ctDNA检测中涉及的688个基因，是否都会检测它们的扩增？

扩增属于拷贝数变异检测（CNV），华梵安™组织或ctDNA检测，都包含CNV（扩增和缺失）分析。华梵安™对于688个基因中的绝大多数基因，都是可以有效检测扩增的。对于一小部分基因，比如化疗用药相关基因，由于没有全长覆盖，扩增的检测性能有限。但这些基因的扩增目前也没有临床指导意义。

06 为什么华梵安™-ctDNA无创肿瘤个体化诊疗基因检测报告中没有检测到基因突变，但TMB依然有检测结果？

血液肿瘤突变负荷（blood-based tumor mutational burden, bTMB）通常指一份肿瘤外周血样本中全外显子测序或靶向测序所检测基因区域每兆碱基中发生的体细胞非同义突变或所有突变的数目。

bTMB源于肿瘤细胞释放到血液循环中的DNA(ctDNA)，bTMB与tTMB正相关，可以在一定程度上反映肿瘤组织的TMB水平。

华梵安™血浆TMB（bTMB）计算采用自主研发的PTAB（Panel-based TMB Analysis process for Blood sample）算法，靶向检测2.79 Mb区域，bTMB=突变个数/Mb，其中突变仅指体细胞突变，包括点突变和插入/缺失突变（包含同义突变），去除已报道的驱动突变（与肿瘤治疗、诊断、预后密切相关的突变，包括热点突变、药物靶点突变、癌基因功能激活突变和抑癌基因功能失活突变）。

bTMB分析所纳入的变异的选取原则与报告所展示的变异不同。比如，TMB分析去除了驱动基因上的变异，并且会纳入同义突变。因此，检测报告没有展示检出变异，是没有检出临床可能相关的基因变异，并不是说送检样本中不存在基因变异。

07 为什么检测报告中有些患者有MMR基因突变，MSI的结果却不是MSI-H？

MSI状态作为一种DNA分子表型，不等同于MMR蛋白表达或MMR基因突变。

MMR蛋白的免疫组化（IHC）结果仅能反映其蛋白相关抗原决定簇表达量，并不能被直接表述为蛋白功能是否缺失、或缺失多少；MMR的高通量测序结果仅能反映其编码基因的变异，不能被直接表述为其编码蛋白是否表达、表达或修饰转运是否有误、蛋白功能是否已受损。已有文献报道显示，MMR-Deficiency不会100%导致MSI-H（PMID: 29329588）。

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