深度长：T细胞疗法的这些细节，你全都知道吗？

本来源于【药明康德(603259)、股吧】微信公众号（ID：WuAppTecChina）

▎药明康德/编译（来源：Immuno-Oncology Research Trends）

近日，一篇讨论肿瘤免疫疗法的章引起了许多行业人士的关注。这篇章发表于“肿瘤免疫疗法研究趋势”网站，作者是杨森制药（Janssen Pharmaceutical Companies）的肿瘤免疫学家Nataša Obermajer博士。在这篇章里，作者深度讨论了两类使T细胞靶向肿瘤的方法——嵌合抗受体（CAR）与双特异性抗体（BsAb）。在今天的报道里，药明康德微信团队也将为各位读者整理这篇章的核心内容。

前言

在最新一代的肿瘤免疫疗法中，科学家们将目光投向了T细胞。利用这些细胞的肿瘤杀伤能力，我们有望设计出全新的抗癌疗法。在过去的几年里，CAR-T细胞疗法与双特异性抗体疗法使T细胞能有效地靶向CD19等抗，为罹患B细胞恶性癌症的患者带来了极好的缓解，也为肿瘤免疫疗法领域带来了革新。

尽管这些创新疗法带来了积极的临床效果，但它们面临着类似的问题：在血液癌症中，它们有潜在的毒性风险。而在实体瘤的治疗上，它们的疗效还尚未得到证实。为此，我们有必要了解这些疗法背后的机理与局限，以及它们在未来的应用潜力。

嵌合抗受体（CAR）

CAR是指一类人工合成的受体，它包括了细胞外的肿瘤抗识别区域，以及一个用于细胞内信号通路的CD3ζ区域。此外，CAR抗体还会包括1到2个共刺激域。当其单链可变片段（scFv）与肿瘤发生结合后，能激活T细胞受体，从而导致T细胞对表达抗的细胞产生反应。

本来源：药明康德

去年，美国FDA批准了两款CAR-T疗法上市，它们分别是诺华的Kymriah （tisagenlecleucel）与Kite Pharma（已被吉利德收购）的Yescarta（axicabtagene ciloleucel）。这两款CAR-T疗法都靶向致癌性B细胞表面的CD19抗：前者治疗B细胞急性淋巴性白血病，能取得高达83%的缓解率；后者则在B细胞非霍奇金淋巴瘤的治疗中，取得了72%的缓解率。

在这两款疗法之外，还有不少CAR-T疗法正在开发之中，它们来自Juno Therapeutics，Celgene，bluebird bio，Mustang Bio，Servier，Pfizer，Cellectis，以及Celyad等生物医药公司。不同研发人员开发的CAR-T疗法，其CAR结构可以很多样化，细胞外结构域，跨膜结构域，以及细胞质结构域都能有所区别。

▲CAR分子的一些设计（图片来源：参考资料[2]）

最近，一些新药研发人员也正在设计全新的CAR。其中一些CAR-T细胞能特异性靶向肿瘤微环境，以克服肿瘤的免疫抑制效果。举例来说，IL4R细胞外结构域与IL7R细胞内结构域的融合，可以靶向细胞因子，从而让T细胞在抑制性细胞因子IL4存在的情况下，依然可以得到激活和增殖；此外，表达趋化因子受体CCR2b的CAR-T细胞也能靶向肿瘤表面高度表达的CCL2；一些CAR能靶向肿瘤血管上过量表达的VEGFR2或αvβ3，增强CAR-T细胞对肿瘤的穿透能力；还有一些新颖的疗法可以将CAR-T细胞作为特定细胞因子或共刺激因子的递送者，增强内源效应T细胞的浸润。

双特异性抗体（BsAb）

在CAR之外，另一个使用单链可变片段（scFv）技术的新领域是双特异性抗体。在上世纪80年代中期，人们造出了首个能将T细胞导向特定抗的双特异性抗体。自那以后，双特异性抗体领域取得了快速的发展。到2017年，这一领域的论总数已经超过了2500篇。目前，绝大部分的双特异性抗体是通过DNA重组技术来生成的，而通过化学方法将两个单克隆抗体进行交联的技术也在一些研究中证明了其可行性。在这一领域的蓬勃发展下，大量双特异性抗体正在临床前和临床试验中验证它们的潜力。通过将T细胞直接引导至靶向细胞，这些T细胞的激活将不受MHC的限制，也不需要依赖于天然T细胞受体的特异性。

双特异性抗体的构型有许多种。一些研究表明，针对某些特定的抗，某种构型可能表现更佳。但通常意义上说，一种结构是不足以满足所有需求的。这是因为单克隆抗体的互动、抗上的表位位置、以及抗在靶向细胞表面的密度与运动性，都会影响到T细胞的激活。

▲一些双特异性抗体的设计（图片来源：参考资料[3]）

在诸多双特异性抗体中，许多研究人员对双特异性T细胞接头（BiTEs）有独特的兴趣。这是一类重组的双特异性蛋白，具有两个相连的单链可变片段，其中一个靶向T细胞表面的分子（如CD3ε），另一个靶向癌细胞表面的抗。这两种单链可变片段被灵活地连接在一起。

2014年，美国FDA批准了能够针对CD19的BiTE分子Blincyto®（blinatumomab），用于费城染色体阴性的复发或难治性B细胞前体急性淋巴性白血病（ALL）的治疗。Blinatumomab由VL-VH向的抗CD19单链可变片段，与VH-VL向的抗CD3单链可变片段，通过G4S连接。由于分子体积较小，这些BiTE的半衰期只有1.25小时。为了克服这一限制，人们正在研究一些新的方法，譬如将BiTE连接到重链片段，或是做出其他新的设计，以提高它在血清里的半衰期。此外，它也能通过连续的输注治疗，确保体内的浓度。

本来源：药明康德

最近，行业对BiTE的体内制造产生了兴趣。其一大策略是通过基因改造的T细胞来产生BiTE，这能克服其半衰期较短的问题。另一种方法是使用溶瘤病毒来表达BiTE。与此同时，研究人员们也指出了BiTE的一大挑战：它的活性取决于肿瘤部位的T细胞种类和密度。倘若这些T细胞都已经耗竭，或都是调节性T细胞，就会影响到BiTE的效果。

另一种双特异性抗体——双链抗体（diabody）是由两条链组成的双价分子，每一条链都具有VH和VL结构域。在双链抗体中，两个可变结构域通过较短的连接子（如G4S）相连。也正是由于这些连接序列较短，双链抗体无法通过链内重组形成抗结合位。相反，这两条链会以“头-尾”的方向形成双聚体，成为一个紧实的分子。如果在同一个细胞内同时表达这两条链，就有望产生双特异性的异体双聚体，带来相应的可变域（VHA-VLB / VHB-VLA，或VLA-VHB / VLB-VHA）。但此类双链抗体的一个潜在问题在于，如果形成同源双聚体，则无法带来正确的可变域（VHA / VLB或VHB / VLA）。一个替代做法是在这两条链的C端上，将半胱氨酸共价链接，即双亲性重靶向蛋白（dual-affinity retargeting proteins, DART）。

作用机制中的关键

T细胞的亚群：在CAR-T细胞疗法中，CD4阳性和CD8阳性的T细胞经常被混在一起进行基因编辑，插入CAR，再被输注回患者体内。尽管CD8阳性的T细胞被认为是杀伤癌细胞的主力军，但CD4阳性的T细胞在装备了CAR之后，同样能被激活，并显示出细胞裂解的活性。同样，在与BiTE分子共同培育时，CD8和CD4阳性的T细胞也都能被激活，诱导靶向肿瘤细胞的死亡。其中的区别在于CD8阳性的T细胞杀伤速度更快。

T细胞的表型：现在我们知道，分化水平越低的CAR-T细胞，在体内的疗效越好。因此，研究人员们期望能尽量产生TSCM（stem memory T cell）与TCM（central memory T cell），并对其保持维持。但在BiTE领域，我们需要不同的T细胞类型。初始T细胞在BiTE的作用下，无法被激活。因此， BiTE介导的细胞毒性，需要和共刺激信号通路无关的T细胞群体参与。

本来源：药明康德

连接的结构域：由BiTE与CAR介导的T细胞-靶向细胞的结合在形式上有所不同。这可能是因为BiTE涉及到了天然的CD3复合体。对于BiTE来说，肿瘤相关抗表位与靶向细胞膜之间的距离，决定了它的活性。这可能是不同双特异性抗体疗效产生差异的因。

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T细胞的扩增：CAR-T细胞在扩增后，可达到体内循环淋巴细胞的20%之多。而对于BiTE来说，大量曾接触过抗的T细胞能直接加以利用，从而减少了对于细胞扩增的依赖。相比CAR-T细胞动辄扩增1000倍以上，在一些BiTE案例中，T细胞只需扩增2-4倍。这一特性有望让BiTE在实体肿瘤的治疗上更具优势。当然，这需要建立在对实体瘤进行良好穿透的前提下。

亲和性：最初，人们认为较低的CD3亲和性（KD ～ 10 ^ -7M或以上）能避免非特异性的T细胞激活。这是因为高亲和性（KD ～ 10 ^ -9M - 10 ^ -8M或以下）的二价CD3结合可能会带来非靶向特异的T细胞激活。但后续的研究则表明这些非特异的激活可能与抗体的交联有关，而非二价结合的直接后果。

T细胞疗法的未来

作者在章中指出，在T细胞疗法领域，未来主要的几大策略包括：

通过提供积极的刺激，或是对免疫检进行抑制，增强临床上的抗肿瘤效果

寻找到创新的靶，以克服实体肿瘤微环境导致的耐受，或是克服恶性血液癌症中由于抗表达下调而导致的获得性耐受

寻找到T细胞的新来源，如异体的通用型T细胞疗法

精准地调控效应细胞，以限制疗法的毒性

先进的CAR工程化技术有望能拓展CAR的结合能力，让其靶向多种不同的抗。如果CAR-T细胞能结合两种抗，并只有在同时结合的情况下才被激活，则有望为这一疗法带来革新。作者指出，这些细胞能先通过第一代CAR技术结合第一种抗，产生第一个信号。接着，通过设计一款嵌合的共刺激CAR（只在没有CD3ζ的情况下发生共刺激），第二款抗能产生第二个信号。在实体瘤领域，类似的肿瘤相关抗的“双靶向”策略有望增强T细胞的选择性，拓展应用前景。为了确保这种方法能取得成功，我们必须对肿瘤相关抗进行仔细的选择，确保它们在细胞表面存在或表达。

最近的一些新型CAR设计保留了CAR的骨架，但使用了单链可变片段之外的结构域。比如有些公司使用的是CD16的细胞外结构域，一些公司开发的T细胞表达有自然杀手细胞的受体（NKG2D），以靶向8种不同的肿瘤配体。

本来源：药明康德

另一些公司正在尝试使用不同的T细胞。比如bluebird bio和苏格兰的生物技术公司TC Biopharm合作，利用gamma delta T细胞，开发针对实体瘤的CAR-T疗法。按设想，这种疗法能选择性地靶向癌细胞，而不会攻健康细胞，从而显著降低毒性。

还有一类新颖的设计是使用药物分子去激活CAR。在这类设计中，CAR的信号元件被分成了几大块。只有在某种药物存在的前提下，它们才会聚集在一起产生信号。由Cellectis授权给Servier与辉瑞（Pfizer）的UCART19就具有类似的开关。只有在rapamycin存在的情况下，CAR-T才会被激活。Bellicum Pharmaceuticals的GoCAR-T疗法同样应用了类似的技术，激活它的药物是rimiducid。

在对T细胞的激活进行调控之外，行业里的另一个热是开发终止CAR-T细胞功能的开关，以限制其短期或长期的毒性。这一般要求在CAR的设计中插入“自杀基因”，以在特殊药物分子的作用下，特异性地摧毁这些细胞，控制副作用。其中，一些装有自杀基因的T细胞疗法已经进入了临床试验阶段，其中一类表达有HSV-TK，一类表达有iCASP9。前者能被ganciclovir激活，“自杀”效果较好，但其免疫性可能会限制其应用（因为它来自于疱疹病毒的胸苷激酶）；后者则是将突变的FKBP12与caspase 9的催化结构域相融合，它的免疫性较好。

后记

在本的最后，作者指出CAR-T细胞疗法与双特异性抗体在不同的临床试验中，各自有其表现出众的地方。值得一提的是，这两种疗法在作用机制上各有千秋，如果患者无法从一种疗法上得到缓解，不代表他们无法从另一种疗法上受益。事实上，有两名患者在接受了blinatumomab的治疗后病情复发，但却在靶向同一抗的CAR-T疗法治疗后达到完全缓解。未来，我们需要更加深入地了解两类疗法的优势，并考虑组合使用的可能。

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参考资料：

[1] Bridging T cells to Tumors: CARs vs BsAb. Retrieved August 9, 2018 from https://immuno-oncologyresearchtrends.com/home/2018/7/21/cancer-re-direction-and-t-cell-therapies-cars-vs-bites-or-tcr-and-immtacs

[2] Zhukovsky et al., (2016) Bispecific antibodies and CARs: generalized immunotherapeutics harnessing T cell redirection, Current Opinion in Immunology, https://doi/10.1016/j.coi.2016.02.006

[3] Velasquez et al., (2018) Redirecting T cells to hematological malignancies with bispecific antibodies, Blood, https://doi/10.1182/blood-2017-06-741058

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