片仔癀对大鼠大脑中动脉阻断所致局灶性脑梗死的影响研究三

一、片仔癀对大鼠大脑中动脉阻断所致局灶性脑梗死的影响研究三

萃中是全球重大的公共卫生问题，萃中的高瘫痪率、高致死率及高复发率不仅严重危害患者的生命健康，同时也给患者家庭和社会带来严重的医疗经济负担。在我国，脑血管疾病已成为我国城市和农村人口的第一、二位致残和死亡原因，且发病有逐年增多的趋势。我国每年约有200万新发萃中的病理，每年死于卒中的人数约有150万人。在脑血管疾病中，缺血性脑卒中占60%~80%,因此探讨缺血性脑卒中的发病机制及药物保护问题显得尤为重要。

中医在脑血管病的病因、病机、预防及治疗等方面取得了显著成果，缺血性脑卒中在中医属中风范畴，中医从“本虚”“淤血”“毒邪”等学说立论、提出补益肝肾、活血化瘀、清热解毒等治疗法则，取得显著的临床疗效，体现了祖国医学独特的优势。

中药复方片仔癀胶囊主要成分为三七、麝香、牛黄、蛇胆、具有消炎、清热解毒、消肿止疼等功效。目前国内外研究证实片仔癀在治疗热毒血瘀所致急慢性病毒性肝炎、痈疽疔疮、无名肿毒、跌打损伤、肿瘤及各种炎症中具有重要作用，片仔癀在脑梗死后对炎症反应和血脑屏障作用的相关研究较少，但从其已知的中药成分我们不难看出，该药在治疗中风方面存在一定的物质基础，尚待进一步扩大该药的应用范围，更好地弘扬我国的传统医学，为解除人类疾患、提高生存质量做出自己的贡献。北京中医药大学东直门医院朱陵群教授团队从蛋白水平、基因水平探讨了片仔癀在脑梗死后抑制炎性损伤、减轻血脑屏障的脑保护的作用机制，为中医药在脑血管病领域药效及机理研究等方面提供更丰富的理论基础。

（一）大鼠大脑中动脉阻塞模型的制备于评价

本研究采用经典的线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞MCAO模型，被多数学者广泛使用。模型制备后，于术后2小时对大鼠进行神经功能学评分，并对其活动度等一般状态进行动态观察。

1、方法

（1）MCAO模型的制备大鼠随机分为手术组和正常组。手术组大鼠参考文献采用改良Zea-Longa方法制备模型。术前禁食12小时，根据体重按lml/100g腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉，固定大鼠，备皮，消毒，麻醉成功后，沿颈正中切开皮肤，钝性分离肌群后暴露右侧颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）、及颈外动脉（ECA），分离右侧CCA、ECA、ICA，结扎ECA及CCA的近心端，在CCA远心端分叉处剪一小口，将尼龙线栓从此小口插入CCA、顺势推入ICA并推进18~22mm，感觉阻力立即停止进线，此时线头已到大脑前动脉入口处，大鼠大脑中动脉阻断成功，最后结扎CCA，两次固定拴线，缝合皮肤，青霉素腹腔注射预防感染。

（2）纳入标准于醒后2小时参照Longa5级标准对其神经功能进行评分，其中1~3分纳入标准，0分和4分视为失败。标准如下

0分无神经功能缺损表现；1分对侧前爪不能充分伸展；2分向外侧转圈；3分行走时向对侧倾倒；4分不能行走，意识丧失。

（3）动物分组将各大鼠随机分为手术组和非手术组。手术组根据术后Longa评分将纳入标准者随机分为模型组、片仔癀高剂量组、（486mg/kg）、片仔癀中剂量组（162mg/kg）、片仔癀低剂量组（54mg/kg）、阳性对照组-尼莫地平组（10.8mg/kg）与脑得生组（486mg/kg）及假手术组。

（4）给药时间及给药方法以上各组均于造模前灌胃给药3天，第4天灌胃给药后30min造模，造模后给药观察至第7天，取材。假手术组和模型组分别给予等体积生理盐水灌胃。脑得生组及尼莫地平组予以混悬液灌胃，研成粉末后溶于双蒸水中配制，模型组和非手术组每日腹腔注射等体积生理盐水，药物每日新鲜配制，各组大鼠每3天称一次体重，根据体重重新计算每只动物的给药量，直到取材当日处死时。

（5）神经功能学评分各组大鼠分别于当日术后2小时进行神经功能学评分。评分标准同上。并对其活动度等一般状态进行动态观察。

2、结果

本实验对MCAO术后2小时的神经功能学评分进行了评价。非手术组无神经功能缺损症状，评分均为0分，术后模型组评分高于非手术组，表明本实验造模成功，可用于后续的实验研究。

（二）用免疫组织化学方法检测片仔癀对大脑中动脉阻断所致局灶性脑梗死大鼠脑源性神经营养因子（BDNF）、IL表达的影响

1、方法

（1）动物模型制备方法、动物分组及给药方法相同“（一）项下1.方法”。

（2）检测指标与方法分别于MCAO手术后第四天随机取各组大鼠8只，经3.5%水合氯酸腹腔注射麻醉后断头取脑，浸于10%的甲酸中固定。取视交前后脑组织常规脱水浸蜡包埋，行连续冠状切片。切片经BDNF染色方法（PV两步法）或IL-6染色方法（PV两步法）制备后，每个切片在40*10/20*10的倍数下，分别于脑梗死中心区、梗死周边区、梗死对侧正常区随机选取5个视野，通过SPOT-II数码成像系统、MetaMorph图像分析系统计算BDNF和IL-6的阳号光密度值。

采用SPSS13.0统计软件包分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2、结果

（1）MCAO术后各组BDNF的表达本实验采用免疫组化染色法，通过DAB显色，可见BDNF广泛分布于中枢神经系统，其蛋白免疫阳性反应为棕黄色。观察各组大鼠在MCAO术后大脑皮层不同区域（梗死中心区、梗死周边区、梗死对侧正常区）的BDNF表达情况，并进行光密度值（OD）分析，其结果如下

BDNF的表达由表5-6-2可见（表略），梗死周边区模型组较假手术组显著升高（P＜0.05），各用药BDNF表达均高于模型组，其中片仔癀高剂量组、片仔癀中剂量组、尼莫地平组较模型组差异显著（P＜0.01），片仔癀高剂量组与片仔癀低剂量组相比差异显著（P＜0.05）。梗死中心区模型组BDNF表达显著低于假手术组（P＜0.01），用药组均高于模型组，脑得生组、尼莫地平组及片仔癀高剂量组与模型组差异显著（P＜0.01或P＜0.05）。梗死对侧正常区模型组BDNF表达较正常组升高，各用药组均高于模型组，但各组间差异无统计学意义。

（2）MCAO术后各组IL-6的表达本实验采用免疫组化PV两步法，通过DAB显色，可见IL-6广泛分布于中枢神经系统，其蛋白免疫阳性反应为棕黄色。观察各组大鼠在MCAO术后大脑皮层不同区域（梗死中心区、梗死周边区、梗死对侧正常区）的IL-6表达情况，并进行OD值分析，其结果如下

IL-6的表达由表5-6-3可见（表略），梗死周边区由表5-6-3可见，梗死周边区模型组较假手术组显著升高（P＜0.01），各用药组IL-6表达均低于模型组，其中片仔癀高剂量组、脑得生组、尼莫地平组较模型组差异显著（P＜0.05），片仔癀高剂量组与片仔癀低剂量组相比差异显著（P＜0.05）。梗死中心区模型组IL-6表达较显著低于假手术组（P＜0.01），用药组均高于模型组，尼莫地平组、脑得生组及片仔癀高剂量组与模型组差异显著（P＜0.01或P＜0.05）。梗死对侧正常区模型组IL-6表达较非手术组升高，各用药组均低于模型组，尼莫地平组表达最低，其次为脑得生组、片仔癀高剂量组、片仔癀中剂量组、片仔癀小剂量组，但均未显示出统计学差异（P＜0.05）。

3、讨论

本实验研究分析，在脑梗死中心区模型组BDNF均较正常组显著降低，给药组均高于模型组。这是因为在缺血中心区，脑组织水肿、变性坏死严重，神经元、神经纤维溶解，导致其表达的各种蛋白成分降低。尼莫地平、脑得生、片仔癀可以减轻脑缺血造成的细胞损伤，促进脑损伤的修复，不同程度地上调梗死中心区BDNF的表达。在梗死周边区，模型组BDNF表达均较正常组显著升高，说明BDNF的高表达可能有利于对损伤的耐受，说明BDNF对脑组织缺血性神经元保护及恢复有重要作用。给予片仔癀后可显著上调BDNF的表达，表明片仔癀可以促进神经元恢复再生。

在脑梗死中心区模型组IL-6均较正常组显著降低，给药组均高于模型组。这是因为在缺血中心区，脑组织水肿、变性坏死严重，神经元、神经纤维溶解，导致其表达的各种蛋白成分降低。尼莫地平、脑得生、片仔癀可减轻脑缺血造成的细胞损伤，促进脑损伤的修复，不同程度地上调梗死中心区IL-6的表达。在梗死周边区，模型组IL-6表达均较非手术组显著升高，表明IL-6的高表达于脑组织病理性损伤密切相关。给予片仔癀后可显著下调IL-6的表达，表明片仔癀可以促进神经元恢复及再生。

李倩等23--25通过研究片仔癀MCAO大鼠大脑皮层梗死周边区神经生长因子（NGF）、水通道蛋白4（AQP4）表达的影响，探讨片仔癀在神经保护、减轻脑水肿方面对缺血性脑血管病的影响和作用机制，结果表明，片仔癀可通过促进局灶性脑梗死大鼠大脑皮层NGF的表达这一途径在一定程度上起到脑保护的作用，通过抑制局灶性脑梗死大鼠大脑皮层梗死周边区AQP4的表达这一途径在一定程度上起到减轻脑水肿、保护血脑屏障的作用。

（三）ELISA法检测片仔癀对大脑中动脉阻断所致局灶性脑梗死大鼠炎性损伤相关因子IL-6、IL-1β、TNF-a的影响

通过免疫组化法证实IL-6在脑梗死后呈高表达状态，给予片仔癀后可下调其表达，我们设计了实验三，进一步通过ELISA法印证片仔癀对血清中IL-6、IL-1β、TNF-a表达的影响，探讨其在脑缺血后抑制炎症反应的作用机制，从而阐明片仔癀具有脑保护的作用。

1、方法

MCAO模型制备方法及动物分组、给药方法同“（一）项下1、方法”。

分别于MCAO术后4天取各组大鼠10~12只，用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉后，经腹主动脉取血、离心后收集上清，ELISA法测定IL-6、IL-1β、TNF-a的OD值。采用SPSS13.0统计软件分析数据，P＜0.05表示有统计学意义。

2.结果

（1）用ELISA法检测片仔癀对MCAO大鼠手术后IL-6表达的影响，结果可见，与假手术组比较，模型组IL-6表达显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，片仔癀高剂量组、脑得生组、尼莫地平组IL-6表达显著降低（P＜0.01或P＜0.05）。片仔癀各组之间无统计学差异。

（2）用ELISA法检测片仔癀对MCAO大鼠手术后IL-1β表达的影响，结果可见，与假手术组比较，模型组IL-1β表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，片仔癀高剂量组、片仔癀中剂量组、片仔癀低剂量组、脑得生组及尼莫地平组IL-1β表达显著降低（P＜0.01或P＜0.05）。片仔癀各组之间无统计学差异。

（3）用ELISA法检测片仔癀对MCAO大鼠手术后TNF-a表达的影响，结果可见，与假手术组比较，模型组TNF-a表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，片仔癀高剂量组、片仔癀中剂量组、片仔癀低剂量组、脑得生组及尼莫地平组TNF-a表达均显著降低（P＜0.01或P＜0.05）。片仔癀各组之间无统计学差异。

3、讨论

本实验研究发现，模型组IL-6较假手术组显著升高，说明IL-6参与了脑梗死后神经病理损伤，给药组均低于模型组。给予片仔癀后可显著下调IL-6的表达，表明片仔癀能够抑制缺血性脑损伤炎性反应，从而起到脑保护的作用。模型组IL-1β较假手术组显著升高。说明IL-1β参与了脑梗死后神经病理损伤，各给药组均低于模型组。给予片仔癀后可显著下调IL-6的表达，表明片仔癀能够抑制缺血性脑损伤炎性反应，从而起到脑保护的作用。模型组TNF-a较假手术组显著升高，说明TNF-a参与了脑梗死后神经病理损伤，各给药组均低于模型组。给予片仔癀后可显著下调TNF-a的表达，表明片仔癀能够抑制缺血性脑损伤炎性反应，从而起到脑保护作用......。

注本章节摘自“片仔癀基础研究与临床应用”一书（由于码字辛苦、可能有遗漏、以“片仔癀基础研究与临床应用”一书为准）；

“个人投资学习笔记，绝没有误导他人的意思，个人观点、仅供参考，希望得到智者指导！